stala michaelisa, Biochemia, Biochemia, Enzymy

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Marian Kuczek
Department of Experimental and Molecular Biology,
University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland
Stała Michaelisa
W 1913 roku Leonor Michaelis i Maund Menten opisali zależność szybkości
reakcji katalizowanej enzymem inwertazą drożdżową od stężenia substratu, czyli od
stężenia sacharozy. Sacharaza, dawniej zwana inwertazą katalizuje reakcję
równowagową hydrolizy sacharozy.
W wyniku hydrolizy sacharozy, zmienia się skręcalność optyczna roztworu,
z prawoskrętnego staje się lewoskrętny, stąd pochodzi stara nazwa enzymu, inwersja
czyli odwrócenie.
W tamtych czasach można było badać aktywność optyczną stosunkowo
stężonych roztworów cukru. Jeżeli za miarę szybkości reakcji hydrolizy przyjmowano
szybkość zmiany kąta skręcenia płaszczyzny polaryzacji światła spolaryzowanego,
wówczas szybkość reakcji nie zależała od stężenia sacharozy i zależała wprost
proporcjonalnie od stężenia enzymu. Reakcje, których szybkość nie zależy od stężenia
substratu nazywa się reakcjami zerowego rzędu (patrz kinetyka reakcji chemicznych).
Wcześniej, Michaelis celem wyjaśnienia zerowego rzędu reakcji wysunął
przypuszczenie, że enzym z substratem wchodzi w reakcję równowagową tworząc
kompleks enzym - substrat, dalsze badania kinetyki tej reakcji powierzył Mount
Menten.
Menten, założyła, że reakcja hydrolizy sacharozy jest reakcją
pierwszego rzędu, czyli pominęła w swoich rozważaniach stężenie wody.
Podejście takie jest często stosowane w badaniach kinetycznych, gdyż
zużycie wody w roztworze wodnym podczas hydrolizy jest praktycznie
niezauważalne. Drugie uproszczenie, to ograniczyła się do badania szybkości
początkowej reakcji, czyli przyjęła:
1. Stężenie substratu nie zmienia się w wyniku powstawania kompleksu enzym
substrat (ES), oraz nie zmienia się w istotnym stopniu podczas przebiegu reakcji, czyli
reakcja biegnie ze stałą szybkością.
2. Zaniedbała szybkość reakcji odwrotnej, syntezy sacharozy z glukozy i fruktozy.
Szybkość reakcji.
Szybkością reakcji nazywamy pochodną stężenia substratu(ów) lub
produktu(ów) po czasie reakcji. Ze względów praktycznych zamiast równia
różniczkowego stosuje się równanie różnicowe a umownie nazywa się je różniczkowym.
v
=
d S
dt
v
»
D
[ ]
S
t
D
Szybkość reakcji inwersji (hydrolizy) sacharozy Menten badała wagowo
i w przeciwieństwie do wcześniejszych badaczy mogła oznaczyć stężenia produktów
reakcji przy bardzo małych stężeniach sacharozy.
Wykonanie
W pierwszych latach ubiegłego stulecia stężenie cukrów redukujących badano
wagowo. W wyniku reakcji zasadowego roztworu soli miedzi 2 powstaje osad tlenku
miedzi 1. Osad ten odsączano, przemywano, suszono i ważono. Metoda ta była bardzo
pracochłonna. W 1944 roku opisano kolorymetryczną metodę oznaczania cukrów
redukujących i od tego czasu jest to najczęściej stosowania metoda.
Do kolejnych probówek dodaje się 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 3, 9 cm
3
0.2 M
roztworu sacharozy w 0.1 M buforze octanowym o pH 4.5, dopełnia się do 9 cm
3
buforem octanowym, miesza się i wstawia do łaźni wodnej o temperaturze 323 K. Po
10 minutach inkubacji w łaźni wodnej, kolejno do każdej probówki, w odstępach co 10
min, dodaje się po 1 cm
3
ekstraktu białek z drożdży ponownie miesza się i umieszcza
w łaźni wodnej. Stężenia sacharozy wynoszą kolejno: 0, 1, 2, 4, 10, 20, 60, 180 mM.
- [ ]
W takich samych odstępach czasu (co 10 min), po każdych 10 minutach dalszej
inkubacji, z kolejnych probówek pobiera się po 0.1 cm
3
roztworu, dodaje do 2.9 cm
3
odczynnika odbiałczającego, miesza, po 5 mim odwirowuje osad białka.
Do 1 cm
3
supernatantu dodaje się 1 cm
3
odczynnika miedziowego (zasadowy
roztwór winianu miedziowego), miesza, wstawia do wrzącej łaźni wodnej na 20 min. Po
ostudzeniu dodaje się 1 cm
3
odczynnika arseno-molibdenowego, wstrząsa do usunięcia
wydzielonego dwutlenku węgla, dodaje się 7 cm
3
wody, miesza i mierzy absorbancję
przy 660 nm. Stężenie cukrów redukujących odczytuje się z wcześniej przygotowanej
krzywej wzorcowej.
Przedstawiona poniżej na wykresie zależność stężenia produktów reakcji od
czasu początkowo układa się liniowo, czyli reakcja w początkowej części wykresu
zachodzi z prawie stałą szybkością. Po długim czasie szybkość reakcji zmniejsza się,
reakcja osiąga stan końcowy.
Wykres nachylenia krzywych początkowego przyrostu stężenia produktów
reakcji od czasu, czyli wykres szybkości początkowej reakcji od stężenia substratu,
przedstawia wycinek hiperboli.
Wraz ze wzrostem stężenia substratu, zwiększa się szybkość reakcji
i asymptotycznie zbliża się do wartości zwanej szybkością maksymalną Vm. Krzywą
zależności szybkości początkowej reakcji od stężenia sacharozy Menten opisała
równaniem zwanym równaniem Michaelis-Menten. Równanie to jest uproszczonym
rozwiązaniem równania reakcji równowagowej po której następuje reakcja
nieodwracalna:
E + S = ES
ES = E + P
gdzie: E - enzym, S - substrat, ES - kompleks enzym substrat, P - produkt.
Zakładając, że szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia
kompleksu ES, że szybkość maksymalna, czyli szybkość początkowa reakcji przy
nieskończenie wielkim stężeniu substratu, jest wprost proporcjonalna do całkowitego
stężenia enzymu, gdyż przy maksymalnie dużym stężeniu substratu, wystąpi
maksymalne przesunięcie równowagi reakcji w kierunku powstawania kompleksu ES.
W warunkach gdy mierzy się szybkość początkową reakcji można zaniedbać ubytek
stężenia substratu oraz przy znikomym stężeniu produktu reakcji można założyć, że
nie powstaje kompleks EP (enzym-produkt) w wyniku reakcji: E + P = EP.
Stała równowagi reakcji dysocjacji ES
K
=
[ ][ ]
[ ]
Przyjmując, że stężenie enzymu [E] w stanie równowagi jest równe stężeniu
całkowitemu enzymu [E(0)] pomniejszonemu o stężenie [ES], molowe stężenie
substratu jest tysiące razy większe od stężenia enzymu zatem powstawanie
kompleksu ES nie zmienia w istotnym stopniu stężenia substratu, równanie to
przyjmuje postać:
E S
ES
[ Pobierz całość w formacie PDF ]